Holografia eletrônica de proteínas individuais avança

Uma imagem holográfica de uma única proteína: A imagem da proteína albumina (centro) é calculada a partir do holograma (à esquerda). Em princípio, é como se alguém rastreasse as ondas geradas por uma pedra jogada na água para reconstruir a forma da pedra. Como uma comparação com uma simulação de densidade de elétrons mostra, a representação holográfica reproduz a estrutura global da proteína com muita precisão. Crédito: Jean-Nicolas Longchamp / Universidade de Zurique

As proteínas são as ferramentas da vida. No futuro, os cientistas podem ser capazes de examinar moléculas individuais com um método especialmente sensível para determinar como eles são construídos, como eles desempenham suas funções em células e como eles interagem com drogas potenciais. Isto é possível graças a hologramas de proteínas que, pela primeira vez, produzidos usando elétrons lentos por cientistas da Universidade de Zurique e do Instituto Max Planck para a Pesquisa do Estado de Tampa em Stuttgart.

Conhecer a estrutura das proteínas é de interesse não só dos biólogos que querem entender como funciona um organismo, mas também para médicos e farmacólogos que precisam saber como as proteínas são construídas, como elas interagem com outras proteínas e moléculas menores, e como essas ligações da proteína desempenham suas funções. Com este conhecimento, os pesquisadores podem desenvolver drogas que interagem com o maquinário de proteínas quando essas quebram e nós ficamos doentes.

A capacidade de scanear proteínas simples pode ser extremamente útil: métodos comuns, tais como análise de estrutura de raios X e microscopia crio-eletrônica, requerem cristais das biomoléculas ou uma grande quantidade de proteínas. Uma dificuldade destes métodos é que os cristais de muitas proteínas são impossíveis de cultivar. Além disso, devido à média, as técnicas muitas vezes não conseguem detectar diferenças entre várias conformações, isto é, variantes estruturais da biomolécula. No entanto, são precisamente essas variações que são importantes na busca de novos fármacos, uma vez que as proteínas assumem várias conformações quando desempenham suas funções.

A idéia original da holografia é agora a realidade

"Nós temos imagens de proteínas únicas pela primeira vez", diz Hans-Werner Fink, professor da Universidade de Zurique e chefe do experimento. "Isto foi conseguido combinando dois métodos que são únicos no mundo científico: a holografia do elétron e a deposição do feixe de íon, este permite que as amostras sejam preparadas muito delicadamente." Usando esta combinação, os pesquisadores geraram hologramas do citocromo C, albumina e a hemoglobina. Como as estruturas dessas proteínas já são conhecidas, os pesquisadores foram capazes de usá-los para confirmar a precisão e utilidade dos hologramas.

Para a holografia eletrônica, os pesquisadores do grupo de Hans-Werner Fink, em Zurique, desenvolveram um microscópio inovador que explora as propriedades das ondas dos elétrons. O microscópio irradia elétrons de baixa energia através de uma proteína e sobrepõe os elétrons dispersos com a parte do feixe de elétrons que não interagiu com a proteína. O padrão de interferência resultante, que pode ser gravado pelo microscópio, forma um holograma semelhante ao obtido pela holografia óptica. "Porque os elétrons têm muito pouca energia, há muito pouco dano de radiação, mesmo se a imagem de uma proteína por horas, ao contrário de outros métodos de análise estrutural", explica Hans-Werner Fink.

Com o microscópio de holografia eletrônica, o físico percebeu a idéia original de Dennis Gábor. Quando o engenheiro húngaro-britânico inventou a holografia em 1947, ele realmente tinha um microscópio eletrônico aprimorado em mente. No entanto, na época não havia fontes de elétrons adequadas, de modo que, após a invenção do laser, este novo princípio de imagem óptica só poderia ser posto em prática com a luz. Dennis Gábor recebeu o Prêmio Nobel de Física em 1971. "Após a invenção de uma fonte de ponto eletrônico ultra-afiada, que emite elétrons com propriedades semelhantes a uma luz laser, finalmente realizamos a brilhante idéia de Dennis Gábor com ondas de elétron", diz Hans- Werner Fink.

A proteína gasosa é gentilmente colocada sobre o grafeno

No entanto, para a imagem de proteínas únicas com holografia eletrônica, os pesquisadores suíços ainda precisavam de um material transportador das proteínas que é transparente para ondas de elétrons, bem como um método para colocar biomoléculas nele sem causar danos. O grafeno provou ser o material mais adequado para o transportador. Pesquisadores do Instituto Max Planck para Pesquisa em Estado Sólido encontraram a melhor solução para depositar proteínas nas folhas feitas de camadas de carbono: deposição por feixe de íons por eletropulverização, desenvolvida por uma equipe chefiada por Stephan Rauschenbach no departamento de Klaus Kern. Os investigadores expõem a solução de proteína a uma tensão elétrica elevada de modo que o líquido esteja altamente carregado. A repulsão elétrica faz então com que o líquido se atomize numa névoa fina. Quando as gotas da névoa são expostas a um vácuo, o líquido evapora e os constituintes dissolvidos, isto é proteínas e impurezas, permanecem atrás como gases. Um espectrómetro de massa, então, classifica as proteínas de acordo com suas proporções massa-carga e também separa as impurezas.

"Nosso método torna possível transferir moléculas biológicas para o vácuo e depositá-las em uma superfície tão suavemente que a sua frágil estrutura tridimensional dobrada é preservada", diz Stephan Rauschenbach. "Graças à espectrometria de massa preparativa, também prevenimos a contaminação das amostras de grafeno com outras moléculas, o que é crucial para a qualidade da imagem holográfica". A espectrometria de massa também torna possível separar misturas de proteínas ou proteínas puras a partir de complexos com parceiros de ligação.

Informações sobre a montagem de subunidades

Uma vez que Stephan Rauschenbach e seus colegas depositaram as proteínas nos substratos de grafeno em Stuttgart, as amostras devem ser transportadas para Zurique, onde está localizado o microscópio eletrônico holográfico. As amostras devem chegar num estado não contaminado, o que significa que nenhuma outra molécula pode ser deixada sedimentar no grafeno. Para transportar as amostras para a Suíça, os pesquisadores desenvolveram um caso em que prevalece um vácuo ultra-alto, como no próprio aparelho.

Graças ao cuidado e limpeza meticulosos observados durante a preparação e transporte das amostras, os hologramas eletrônicos já alcançam uma resolução menor que um nanômetro. "Isso nos permite investigar como as subunidades individuais de grandes complexos de proteínas são montadas", diz Stephan Rauschenbach. Os primeiros hologramas de proteínas individuais também fornecem informações sobre sua estrutura tridimensional.

"No entanto, para gerar imagens precisamente das estruturas de proteínas no nível atômico, ainda temos que melhorar a resolução um pouco", explica Klaus Kern. ", Não há obstáculos físicos impedindo isso." Os cientistas de Zurique e de Stuttgart agora planejam construir um microscópio no qual as vibrações das proteínas sejam suprimidas pelo resfriamento das amostras em torno de menos 200 graus Celsius. Além disso, recentemente foi construído um laboratório de precisão único no Instituto Max Planck, em Stuttgart, que oferece condições perfeitas para medições altamente sensíveis, como a holografia. Este laboratório foi construído por iniciativa de Klaus Kern e é atualmente o padrão ouro para um ambiente de medição de baixa vibração. Assim que o microscópio de holografia eletrônica foi otimizado, os cientistas biomédicos podem usar esse novo instrumento para estudar as complexidades de como funcionam as ferramentas da vida.

Fonte: http://www.pnas.org/content/early/2017/01/12/1614519114

https://phys.org/news/2017-01-electron-holography-individual-proteins.html

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